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NRK-52E 大鼠腎細胞詳解

起源與背景

細胞特性

1. 形態(tài)與生長特征
   • 形態(tài)學(xué)：貼壁生長時呈鵝卵石樣或多邊形單層排列，細胞邊界清晰，細胞質(zhì)豐富且透光性好，細胞核大而圓，位于細胞中央（顯微鏡下可見典型的上皮細胞鋪路石樣結(jié)構(gòu)，圖 1）。
   • 生長動力學(xué)：
     • 倍增時間約24-36 小時，傳代周期 3-4 天，建議使用20 代以內(nèi)細胞以維持穩(wěn)定表型。
     • 密度達 80%-90% 時需傳代，過度匯合可能導(dǎo)致細胞接觸抑制，甚至出現(xiàn)去分化現(xiàn)象（如極性丟失、間質(zhì)標(biāo)志物表達增加）。
2. 表型與功能標(biāo)志物
   • 上皮細胞特異性標(biāo)記：
     • 高表達細胞角蛋白 18（CK18）、E - 鈣粘蛋白（E-Cadherin）、緊密連接蛋白（ZO-1、Occludin），免疫熒光染色可見細胞膜或細胞質(zhì)呈陽性（圖 2）。
     • 功能性蛋白：鈉 - 葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白 2（SGLT2）、Na?/K?-ATP 酶（位于基底膜，維持離子梯度）、水通道蛋白 1（AQP1，參與水分重吸收）。
   • 病理應(yīng)激響應(yīng)：
     • 高糖誘導(dǎo)損傷：25 mM 葡萄糖處理可激活 PKC 通路，導(dǎo)致活性氧（ROS）生成增加、TGF-β1 分泌升高，進而誘導(dǎo)上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），表現(xiàn)為 α-SMA（間質(zhì)標(biāo)志物）表達上調(diào)、E-Cadherin 表達下降。
     • 順鉑毒性模型：通過順鉑（10-20 μM）處理可模擬 AKI，誘導(dǎo)細胞凋亡（Annexin V/PI 雙染陽性率升高）和炎癥因子（如 IL-6、MCP-1）釋放。
3. 體外功能驗證模型
   • 跨膜轉(zhuǎn)運功能：利用 Transwell 小室檢測跨膜電阻（TER）（正常 TER 值約 500-800 Ω?cm2）和熒光標(biāo)記物（如 FITC - 葡聚糖）的通透性，評估緊密連接完整性。
   • 細胞外基質(zhì)（ECM）合成：在 TGF-β1（5 ng/mL）刺激下，可顯著增加 **Ⅰ 型膠原、纖連蛋白（FN）** 的 mRNA 和蛋白表達，模擬腎小管間質(zhì)纖維化過程。

培養(yǎng)與保存條件

1. 基礎(chǔ)培養(yǎng)方案
   • 培養(yǎng)基：經(jīng)典配方為 DMEM/F12（1:1 混合）+10% 胎牛血清（FBS）+1% 雙抗（青霉素 / 鏈霉素），部分實驗為增強上皮特性可添加胰島素 - 轉(zhuǎn)鐵蛋白 - 硒（ITS）復(fù)合物（1×）。
   • 培養(yǎng)環(huán)境：37℃、5% CO?恒溫培養(yǎng)箱，濕度≥95%，pH 7.2-7.4。
   • 傳代操作：
     • 消化：0.25% 胰酶 - EDTA 室溫消化 30 秒 - 1 分鐘，鏡下觀察細胞變圓、間隙增大時終止消化（避免過度消化導(dǎo)致細胞成團或損傷）。
     • 傳代比例：1:2-1:3（按細胞密度調(diào)整），接種密度建議5×10? cells/cm2。
2. 凍存與復(fù)蘇要點
   • 凍存液：90% FBS + 10% DMSO（或使用商業(yè)化細胞凍存液），細胞密度調(diào)整為1×10?-3×10? cells/mL，程序降溫（-80℃過夜后轉(zhuǎn)液氮）。
   • 復(fù)蘇技巧：37℃水浴快速解凍（≤1 分鐘），離心（800 rpm×5 分鐘）去除凍存液后，接種于含 15% FBS 的培養(yǎng)基中，24 小時內(nèi)更換培養(yǎng)液以清除死細胞。

應(yīng)用領(lǐng)域與典型研究

1. 糖尿病腎?。―N）機制研究
   • 高糖 / AGEs 模型：通過高葡萄糖（25 mM）或 AGE-BSA（100 μg/mL）處理細胞，研究mTOR 通路激活對 ECM 沉積的影響，或篩選 PPAR-γ 激動劑（如羅格列酮）對 EMT 的抑制作用。
   • 氧化應(yīng)激與炎癥：檢測高糖條件下 NADPH 氧化酶（NOX4）表達及 NLRP3 炎癥小體激活，探討 Sirtuin 家族蛋白（如 SIRT1）的腎保護機制。
2. 急性腎損傷（AKI）與藥物毒性評估
   • 順鉑 / 慶大霉素毒性模型：通過劑量梯度實驗（順鉑 5-20 μM）建立 AKI 細胞模型，檢測腎損傷分子 - 1（KIM-1）、NGAL的分泌水平，或驗證抗氧化劑（如 N - 乙酰半胱氨酸）的保護效應(yīng)。
   • 新型藥物腎毒性篩選：利用 CCK-8 法、LDH 釋放實驗評估候選藥物對 NRK-52E 細胞的存活率影響，結(jié)合流式細胞術(shù)分析凋亡（Annexin V）和壞死（PI）比例。
3. 腎小管上皮細胞生物學(xué)研究
   • EMT 與纖維化機制：TGF-β1 誘導(dǎo) EMT 模型中，研究 miRNA-21/PTEN 通路對細胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控，或探索間充質(zhì)干細胞外泌體對 EMT 的逆轉(zhuǎn)作用。
   • 細胞極性與轉(zhuǎn)運功能：通過 RNA 干擾敲低 ZO-1，觀察緊密連接破壞后溶質(zhì)轉(zhuǎn)運異常，或研究 Wnt/β-catenin 通路對上皮極性的維持作用。
4. 腎臟修復(fù)與再生研究
   • 生長因子促進修復(fù)：探討肝細胞生長因子（HGF）或表皮生長因子（EGF）對劃痕**實驗中細胞遷移的促進作用，或驗證低氧預(yù)處理（1% O?）對細胞抗損傷能力的增強效應(yīng)。
   • 表觀遺傳調(diào)控：研究組蛋白去乙?；福℉DAC6）抑制劑對 NRK-52E 細胞線粒體功能的保護作用，或分析長鏈非編碼 RNA（如 lncRNA MALAT1）在 AKI 中的表達變化及機制。

局限性與注意事項

1. 模型局限性
   • 永生化帶來的功能偏差：與原代近端小管細胞相比，NRK-52E 細胞的刷狀緣酶（如堿性磷酸酶、γ- 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶）活性較低，部分藥物代謝酶（如 CYP450）表達缺失，復(fù)雜代謝研究需結(jié)合原代細胞或肝 - 腎共培養(yǎng)模型。
   • 株系特異性：不同實驗室保存的 NRK-52E 細胞可能存在微小遺傳差異，建議通過短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）鑒定確認細胞身份，避免交叉污染（如與成纖維細胞株混淆）。
2. 實驗設(shè)計注意事項
   • 血清饑餓處理：在刺激實驗（如細胞因子、藥物處理）前，建議用無血清培養(yǎng)基饑餓 12-24 小時，以排除血清中生長因子的干擾（如 EGF 可能激活 MAPK 通路）。
   • 多重模型驗證：關(guān)鍵機制研究需結(jié)合體內(nèi)模型（如大鼠順鉑腎損傷模型）或類器官模型（如腎小管類器官），以彌補體外模型與真實病理環(huán)境的差異。
3. 質(zhì)量控制
   • 污染檢測：定期通過支原體檢測試劑盒（如 qPCR 法）排除污染，避免真菌、細菌或交叉污染導(dǎo)致實驗結(jié)果不可靠。
   • 表型穩(wěn)定性：傳代超過 20 代后，部分細胞可能出現(xiàn) EMT 樣表型（如 α-SMA 基礎(chǔ)表達升高），建議凍存低代次細胞（≤10 代）并定期復(fù)蘇使用。

總結(jié)